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A citometria de fluxo é uma técnica versátil realizada em um equipamento chamado citômetro de fluxo. Essa metodologia possui aplicações em diversas áreas, como imunologia, hematologia, biologia celular, virologia, biologia do câncer e monitoramento de doenças infecciosas.
Os avanços tecnológicos nessa área ampliaram significativamente a capacidade de investigação do sistema imunológico e de vários aspectos da biologia celular, permitindo análises mais precisas.
A seguir, confira o conceito da técnica, como funciona e suas aplicações no laboratório clínico.
Para introduzir a técnica, podemos começar pela etimologia do termo. Dividido em três partes, o nome revela o conceito da tecnologia: “cito” significa célula, “metria” refere-se a medida e “fluxo” está relacionado a um sistema fluido.
Assim, a citometria de fluxo é uma técnica laboratorial que permite analisar, quantificar e separar células em uma suspensão líquida enquanto estas passam individualmente por um ou mais feixes de luz que permitem mensurá-las através de detectores acoplados ao citômetro de fluxo.
O citômetro permite uma ampla gama de aplicações, desde pesquisa básica até diagnósticos clínicos avançados, como a imunofenotipagem. A versatilidade da citometria de fluxo a torna uma ferramenta indispensável em laboratórios modernos.
Ao analisarmos uma amostra de células no citômetro de fluxo, é possível avaliar suas propriedades físicas, incluindo estruturas intracelulares e extracelulares, a partir da marcação com anticorpos acoplados a fluorocromos (moléculas fluorescentes).
Dessa forma, diversos tipos celulares podem ser analisados por esse método, incluindo células de mamíferos, bactérias, fungos e outras estruturas celulares como o DNA e até mesmo microvesículas.
O citômetro de fluxo possui três sistemas principais que permitem a análise simultânea de diversas células em um curto intervalo de tempo: o sistema fluídico, o sistema óptico e o sistema eletrônico.
As células, suspensas em um líquido, são aspiradas pelo equipamento e alinhadas em fila única por meio de um fluxo de líquido estreito, que garante a análise individualizada de cada célula na amostra. No interior do equipamento, as células são interceptadas por um ou mais lasers, e a luz dispersa é captada por um sistema óptico. Esse sistema permite identificar características como tamanho, granularidade interna e fluorescência.
Cada célula analisada gera um sinal detectado pelos sensores do equipamento, que o convertem em sinais elétricos. Esses dados são então apresentados em uma tela de computador, possibilitando sua posterior análise gráfica, de acordo com os parâmetros avaliados.
A técnica permite avaliar os parâmetros Foward Scatter (FSC) que se refere ao tamanho da célula, Side Scatter (SSC) referente a granularidade celular interna e a fluorescência. A fluorescência é um dos principais parâmetros avaliados na citometria de fluxo e depende do uso de fluorocromos (ou fluoróforos), que são moléculas fluorescentes. Na citometria de fluxo, esses fluorocromos são comumente conjugados a anticorpos monoclonais para marcar e avaliar a expressão de antígenos de interesse.
Um grupo internacional de especialistas introduziu a nomenclatura “Cluster de Diferenciação” (CD) para os antígenos celulares. Esse sistema estabeleceu uma classificação padronizada para os anticorpos que reconhecem antígenos específicos. Dessa forma, amostras de células marcadas com anticorpos conjugados a fluorocromos podem ser classificadas em populações distintas com base em seus padrões de fluorescência.
O CD3 (Cluster de Diferenciação 3), por exemplo, é usado para identificar o co-receptor presente em todas as células T. Anticorpos anti-CD3 conjugados a fluorocromos marcam as células que expressam esse antígeno. Quando iluminadas pelo laser do citômetro, as células emitem fluorescência, permitindo a identificação dessa população de células.
Esse processo é fundamental na imunofenotipagem, por exemplo, permitindo a identificação precisa de diferentes populações celulares.
A imunofenotipagem é uma das principais aplicações da citometria de fluxo. Nas neoplasias hematológicas, esse exame permite identificar e quantificar populações e subpopulações de células sanguíneas, além de avaliar o grau de maturação celular e o percentual de células neoplásicas.
Para isso, são utilizados anticorpos específicos contra os clusters de diferenciação (CD) das células sanguíneas, permitindo a análise detalhada da amostra do paciente. Essa abordagem possibilita identificar a linhagem celular afetada pela doença (como mieloide ou linfoide) e classificar as neoplasias como agudas ou crônicas, com base no estágio de maturação e no percentual de células alteradas.
Dessa forma, a imunofenotipagem é essencial para o diagnóstico, prognóstico e monitoramento dessas doenças.
A citometria de fluxo é amplamente utilizada em diferentes áreas da medicina diagnóstica. Algumas das principais aplicações incluem:
As células CD4 coordenam o sistema imunológico, enquanto as CD8 eliminam células infectadas pelo HIV. O HIV destrói as CD4 invertendo a relação CD4/CD8, que em pessoas saudáveis favorece um maior número de células T auxiliares (CD4).
O monitoramento dessa relação é essencial para avaliar a saúde imunológica e o sucesso do tratamento.
O Fator de Aceleração da Decadência (DAF/CD55) e a proteína inibidora de MAC (CD59) protegem as células sanguíneas contra o ataque imunológico. Na HPN, alterações genéticas diminuem ou eliminam essas proteínas, tornando as células vulneráveis à destruição e levando à hemólise crônica e outras complicações.
Rapidez e Eficiência: A capacidade de analisar milhares de células por segundo permite resultados rápidos e precisos.
Análise Multiparamétrica: Possibilita a análise simultânea de várias características celulares, como marcadores de superfície e intracelulares.
Alta Sensibilidade e Especificidade: Detecta alterações sutis em populações celulares, sendo essencial em diagnósticos complexos.
Monitoramento Longitudinal: A tecnologia é ideal para acompanhar a evolução de doenças e a resposta a tratamentos.
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